HPLC kolonları

Faz grupları

Ters faz kolonlar

Analizlerin büyük bölümü ters faz kolonlarla yürütülür. C18 fazı genel amaçlı kullanım için standarttır; C8 daha kısa tutulma, C4 ise büyük biyomoleküller için uygundur. Geniş gözenekli (300 Å) versiyonlar protein ve peptit analizlerinde, %100 su uyumlu versiyonlar ise tamamen sulu mobil fazlarda kullanılır. Fenil, pentaflorofenil ve C30 gibi alternatif seçicilikler, C18 ile ayrılamayan bileşiklerde çözüm sunar.

Normal faz ve HILIC kolonlar

Bağlanmamış silika, siyanopropil ve aminopropil fazlar normal faz uygulamaları için; HILIC kolonlar ise polar bileşiklerin ters fazda tutunmadığı durumlar için kullanılır. HILIC tarafında asidik, bazik ve nötr yüzey seçenekleri bulunur.

İyon değişim ve boyut dışlama

Kuvvetli ve zayıf anyon/katyon değiştirici kolonlar; nükleotit, organik asit ve protein analizlerinde kullanılır. Boyut dışlama kolonları silika ve polimer matris seçenekleriyle, molekül ağırlığına göre ayırma yapar. Şeker ve organik asit analizleri için ligand değişim kolonları ayrı bir grup oluşturur.

Kiral kolonlar

Polisakkarit esaslı kiral fazlar, enantiyomerlerin ayrılmasında kullanılır. Kaplamalı fazlarda çözücü uyumu sınırlıdır; tetrahidrofuran ve klorlu çözücülerle çalışılacaksa immobilize faz gerekir. Protein esaslı kiral fazlar da belirli bileşik grupları için tedarik edilebilir.

Ön kolonlar

Ön kolon kartuşu, analitik kolondan önce yerleştirilir ve partikül ile güçlü tutunan safsızlıkları tutar. Kartuş maliyeti analitik kolonun küçük bir yüzdesi kadardır; kirli matrislerle çalışan laboratuvarlarda kullanımı kolon ömrünü belirgin biçimde uzatır.

Seçim kriterleri

• Tanecik boyutu: Küçük tanecik daha keskin pik verir, sistem basıncını yükseltir. Cihazın basınç sınırı belirleyicidir.
• Gözenek çapı: Küçük moleküllerde 100–120 Å, protein ve peptitlerde 300 Å ve üzeri kullanılır.
• pH dayanımı: Metodun pH aralığı, kolon ömrünü belirleyen en kritik parametredir.
• Silika tipi: Yüksek saflıkta silika, bazik bileşiklerde pik kuyruğunu azaltır.
• Ölçeklenebilirlik: Analitikten preparatife geçiş planlanıyorsa aynı faz ailesinde ilerlemek metot transferini kolaylaştırır.

Metot, mevcut kolon özellikleri ve numune matrisi iletildiğinde; eşdeğer faz önerisi boyut ve teknik gerekçesiyle birlikte sunulur.

Teknik değerlendirme

Pik kuyruğu, artan geri basınç ve tutulma kayması gibi sorunların kaynağı çoğu zaman mobil faz değil kolonun kendisidir. Kolon değişimi öncesinde yıkama ve şartlandırma prosedürünün uygulanması önerilir.

Kolon ömrünü uzatan en etkili uygulama ön kolon kullanımıdır. Serum, gıda ekstraktı ve atık su gibi kirli matrislerde ön kolonsuz çalışmak, analitik kolon maliyetini birkaç katına çıkarır.

Biyomolekül kolonları farklı saklama ve şartlandırma koşulları gerektirir; teslimat sırasında kullanım talimatı birlikte gözden geçirilir.