HPLC vial nasıl seçilir?

İlk ölçüt: otomatik örnekleyici uyumu

Vial seçiminin ilk ölçütü cihazdır. Otomatik örnekleyicinin rafı vial gövde ölçüsünü, iğne derinliği ise vialin boyunu ve septum kalınlığını sınırlar. Standart HPLC vialleri 11,6 × 32 mm gövdeye sahiptir ve 1,5 mL hacim sunar; bu ölçü çoğu analitik cihazın rafına uyar.

Cihaz kılavuzunda önerilen vial tipi ve kapak ölçüsü yazılıdır. Bu bilgi baştan teyit edilirse sipariş sonrası uyumsuzluk yaşanmaz; özellikle farklı üreticilerin cihazlarının bir arada kullanıldığı laboratuvarlarda tek tip vial seçimi stok yönetimini de sadeleştirir.

Doldurma seviyesi ve iğne derinliği

Vialin ne kadar doldurulacağı, otomatik örnekleyicinin iğne derinliğine ve enjeksiyon hacmine bağlıdır. İğne genellikle vial tabanının biraz üzerinde durur; numune seviyesi bu noktanın altına düşerse cihaz hava çeker ve enjeksiyon tekrarlanabilirliği bozulur.

Öte yandan vialin tamamen doldurulması da sorun yaratır. Septum delindiğinde içerideki basınç dengelenemez, numune geri itilebilir veya kapak sızdırabilir. Pratikte vialin yaklaşık üçte ikisinin doldurulması, hem yeterli numune hem de üst boşluk sağlar.

Aynı vialden çok sayıda enjeksiyon yapılacaksa toplam çekilecek hacim önceden hesaplanır ve vialdeki numune buna göre ayarlanır.

Ağız ölçüsü ve kapak tipi

HPLC viallerinde üç yaygın ağız tipi bulunur. Her birinin kapanma şekli ve sızdırmazlık düzeyi farklıdır.

• ND8 (8-425 diş): Klasik vidalı yapı; 8-425 vidalı HPLC viali birçok eski ve yeni cihazla uyumludur.
• ND9 (9 mm kısa diş): Yarım tur kapanan geniş ağızlı yapı; iğne hizalamasını kolaylaştırır. 9 mm vidalı HPLC viali laboratuvarlarda en sık kullanılan tiptir.
• ND11 (11 mm crimp): Alüminyum kapak presle sıkılır; 11 mm crimp HPLC viali uçucu numunelerde ve uzun saklamada daha yüksek sızdırmazlık sağlar.

Vidalı kapaklar elle takılır ve açılır; günlük rutin analizler için pratiktir. Crimp kapaklar ise sıkma aleti gerektirir, ancak kapak-septum basıncı sabit olduğu için buharlaşma kaybı en azdır. Kapak seçenekleri vidalı vial kapakları ve alüminyum crimp kapaklar sayfalarında yer alır.

Cam tipi, renk ve hacim

Analitik viallerde genellikle borosilikat cam kullanılır. Borosilikat cam kimyasal olarak dayanıklıdır ve numuneye iyon salımı düşüktür. Bazik bileşiklerle veya çok düşük derişimlerle çalışılıyorsa yüzeyi işlem görmüş (deaktive) cam seçenekleri ayrıca değerlendirilir. Laboratuvar camının sınıflandırması ASTM E438 standardında tanımlanır.

Işığa duyarlı bileşikler (bazı vitaminler, pigmentler, ilaç etken maddeleri) için amber cam tercih edilir. Amber cam UV ve kısa dalga boylu görünür ışığı süzerek numunenin otomatik örnekleyicide beklerken bozulmasını azaltır.

Az numuneyle çalışma

Numune hacmi 1 mL'nin altındaysa standart vialin dibinde kalan ölü hacim sorun yaratır. Bu durumda vial içine yerleştirilen HPLC vial insörtü kullanılır; 150-350 µL hacimlerde konik ve düz tabanlı seçenekler bulunur. İnsört takma işini ortadan kaldırmak için insörtü takılı vial de tercih edilebilir.

HPLC vial seçiminde septum malzemesi

Septum, iğnenin geçtiği ve numuneyi dış ortamdan ayıran contadır. Septumun numuneye bakan yüzü kimyasal uyumu belirler, arka katmanı ise iğne çekildikten sonra deliğin kapanmasını sağlar.

• PTFE/silikon: Numuneye yalnızca PTFE temas eder; organik çözücüler ve eser analiz için uygundur. Ayrıntılar PTFE/silikon septum sayfasındadır.
• Tek katmanlı silikon: Esnektir ve çok delmede iyi kapanır; ancak silikon, bazı çözücülerle etkileşebilir. Tek katmanlı silikon septum rutin ve sulu numunelerde kullanılır.
• Ön kesikli septum: İğnenin septumu kolay geçmesini sağlar, iğne bükülmesini ve septum parçacığı kopmasını azaltır; ancak buharlaşma koruması düz septuma göre düşüktür.

Aynı viale birden fazla enjeksiyon yapılacaksa septumun geri kapanma özelliği, tek enjeksiyonda ise kimyasal uyum öncelikli ölçüttür.

Numune hazırlığı ve headspace viallerinden farkı

Viale konulan numunedeki partiküller iğneyi ve kolonu tıkar. Bu nedenle numune, viale alınmadan önce uygun membranlı bir şırınga filtresinden geçirilir. Membranın çözücüyle uyumu şırınga filtresinde membran seçimi rehberinde anlatılır; seçenekler şırınga ucu filtreler sayfasında yer alır.

GC'de uçucu bileşiklerin buhar fazından analiz edildiği headspace yöntemi ise farklı bir vial gerektirir. Bu uygulamalarda 10 ve 20 mL hacimli crimp headspace viali veya vidalı headspace viali kullanılır. Tüm vial, kapak ve septum seçenekleri vial, kapak ve septum kategorisinde toplanmıştır.

Uçucu ve hassas numunelerde dikkat edilecekler

Uçucu çözücüler ve düşük kaynama noktalı bileşikler, septum delindikten sonra hızla buharlaşabilir. Uzun sıralı analizlerde bu durum, ilk ve son enjeksiyon arasında derişim farkı yaratır. Bu tür numunelerde crimp kapak, ön kesiksiz septum ve soğutmalı otomatik örnekleyici birlikte değerlendirilir.

Çok düşük derişimli numunelerde ise analitin cam yüzeyine tutunması (adsorpsiyon) sorun olabilir. Özellikle bazik bileşikler ve bazı peptitler bu açıdan hassastır. Böyle durumlarda deaktive cam veya polipropilen vial seçenekleri, yöntem geliştirme aşamasında karşılaştırmalı olarak denenir.

Sık yapılan hatalar

• Vialin ağzına kadar doldurulması; iğne hava çekemez ve vakum oluşur
• Vidalı kapağın aşırı sıkılması; septum içe doğru bombe yapar ve iğneyi saptırır
• Farklı üreticilerin vial ve kapaklarının karıştırılması
• Işığa duyarlı numunenin şeffaf vialde uzun süre bekletilmesi
• Kolonun korunması için filtrasyonun atlanması; partikül sorunu HPLC kolonu ömrünü kısaltır

Stok ve tedarik planlaması

Vial, kapak ve septum, laboratuvarın en hızlı tükenen sarfları arasındadır. Valide edilmiş bir yöntemde kullanılan vial ve kapak kombinasyonunun değiştirilmesi, yöntemin yeniden doğrulanmasını gerektirebilir. Bu nedenle kullanılan ürünlerin kodlarının kayıt altına alınması ve yıllık tüketime göre stok planı yapılması önerilir.

Aynı vial tipinin farklı partileri arasında ölçü ve kalite tutarlılığı da önemlidir. Kalite belgesi ve parti izlenebilirliği sunan tedarik, denetimlerde istenen kayıtların hazırlanmasını kolaylaştırır.

Sıkça sorulan sorular